FASTQ 檔案介紹

隨著次世代定序 (NGS) 越來越普及，產生的資料越來越多，Fastq 這種描述鹼基序列 (Nucleotide Sequence) 的檔案格式也使用的越來越多，本篇想要整理一些有關 Fastq 檔案介紹，像是 Fastq Data Format 與如何利用 Fastq 做 Quality Control (QC)?

FASTQ Format：

網路上蠻多關於 FastQ 格式介紹的資料，我們已以下的範例來介紹一個 Fastq 的檔案通常會有哪一些資訊，以下的資訊是一個鹼基序列的表示方法：

@NB552005:36:HKNVTAFXY:1:11101:2719:1049 2:N:0:ATCACGAC+AAGGTTCA
CACTTGTCAGGAGTTTGAGACCAGCCTGGCCAACATGGCGAAAACCCGTCTCTACTAAAATACAAAAATTAGTCAGGTGATGTGGTGGGCATCTGTAATCCCAGCTACTCGGAAGGCTGAGACAGAAGAATCGCTTGAACCTGGGAAGTGG
+
AAAAAEEEEEE/EEEEE/EEAAAEAAEEEEA/EEEEEEEEA/AEEAEEEAEAEEAEEA<EEEEEEE<A<AEEAA<EEEE//E/EEEEEEEEEEEAEEEEAEE<EE/<EAEEEA/EEEEE/A/AEE/A//<AAEAEAE//AEE<<EEEEAE<

通常 Fastq 裡面會有很多像是以上的鹼基序列，一個鹼基序列會由四個部分組成：

1. @ 之後包含很多產生鹼基序列的資訊：
2. 讀取到的鹼基序列（包含 Adaptor）
3. + 是分隔符號
4. 關於鹼基序列的信心信號

Single-Read Run v.s Paired-End Run 參考

Fastq 檔案主要可以分成兩種，一種是 Single-Read，這種 Fastq 產生主要是從 DNA 的其中一端讀進資料，另外一種是 Paired-End Fastq，這類 Fastq 一般會用兩個檔案 (R1, R2) 描述同一個 Sample Nucleotide Sequences，Fastq 的檔案都是以 *.fastq.gz 爲他的檔名，以下我們提供一個 Paired-End 的例子：

Read 1：(如果只有一個檔案 Read 1 就是 Single-Read)

@NB552005:36:HKNVTAFXY:1:11101:14761:1033 1:N:0:ATCACGAC+AAGGTTCA
CCCAGNTTAGAGTGCGATGACGCCATCTCGGCTCACTACAACCTCCATCTCCTGGGTTCAAGTGGTTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTAGCAGGGATTACAGGGGCACATTACCACGACCGGCTAATTTCTGTATTTTTAGTAGAGA
+
AAAAAEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEE6EEEEEEEEEEEEEEEAEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEAEEEEEEEEEEEEEEEEEEEAEEEEEEEEE<EEEE/EEEEE/EEEEEEEEE<EEEEAEEEEEEEEEEEEEE

Read 2：(如果是 Paired-End Fastq 就會同時有 Read 1 與 Read 2)

@NB552005:36:HKNVTAFXY:1:11101:14761:1033 2:N:0:ATCACGAC+AAGGTTCA
TCTCTACTAAAAATACAGAAATTAGCCGGTCGTGGTAATGTGCCCCTGTAATCCCTGCTACTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGAACCACTTGAACCCAGGAGATGGAGGTTGTAGTGAGCCGAGATGGCGTCATCGCACTCTAACCTGGG
+
AAAAAEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEAEEEEEEEEEE<EEEEEEEEEEEEE<EEEEAEEEEEEEEEEEEEEAEEAAEE/EEAEEAA/EEEAAEEE<E/EEEEEE

由於 Paired-End Fastq 是同一個 DNA 從不同端讀出來的結果，但是一般定序儀的精準度在 150bp 之後會大幅下降，Read1 讀到的是左半部，Read2 讀到的是右半部，然後中間有重疊的部分，以上的 Sample 比較特別，直接 Reverse Read 2 就可以跟 Read 1 匹配了，這代表取樣的基因序列差不多就是 150 bp 的長度

CCCAGNTTAGAGTGCGATGACGCCATCTCGGCTCACTACAACCTCCATCTCCTGGGTTCAAGTGGTTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTAGCAGGGATTACAGGGGCACATTACCACGACCGGCTAATTTCTGTATTTTTAGTAGAGA
GGGTCCAATCTCACGCTACTGCGGTAGAGCCGAGTGATGTTGGAGGTAGAGGACCCAAGTTCACCAAGAGGACGGAGTCGGAGGGCTCATCGTCCCTAATGTCCCCGTGTAATGGTGCTGGCCGATTAAAGACATAAAAATCATCTCT

再來看另外一個範例：

Read 1：

@NB552005:36:HKNVTAFXY:1:11101:10343:1028 1:N:0:ATCACGAC+AAGGTTCA
TAATTNGTTTGTTTGTTTGAGATGGAGTTTCGCTCTGTCACCCAGGCTGGAGTATAGTGGCGTGATCTCGGCTCACTGCAACCTCCATCTCCCAGATTCAAGTGAGTCTCCTGCCTCAGCCTGCTGGGTAGTTCAGATTATAGGCATGTGC
+
AAAAAEEEEEEEEEEEE<EEEEEEEEEAEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEE/EEEEEEEEE/EAEEAEEEEEEEEEEEE<EEEEEEEEE/EEEEEEEEAEEAEE/EAEEEEEEAEEEEEEAAE<EEEEEEEEEE/AAA

Read 2：

@NB552005:36:HKNVTAFXY:1:11101:10343:1028 2:N:0:ATCACGAC+AAGGTTCA
CACTTGTCAGGAGTTTGAGACCAGCCTGGCCAACATGGTGAAACCCTGTCTGTACTAAAAATACAAAAATTAGCCAGGCGTGGTGGCACATGCCTATAATCTGAACTACCCAGCAGGCTGAGGCAGGAGACTCACTTGAATCTGGGAGATG
+
AAAAAAE/EEEEEEEEEAEEAEEEEE/EE<EEEEEE/AEEEAEEAEEAAEEEAEEEEEAAEEEEEEAE/EAAA/EAEEEEEEEEAEA/EAEEE<EEEEEEEEEAEEAEEEEEEE<EEEEEAEEAAEEEEEAA</A<<EE<EEEEEAEEEEE

可以發現這一組 Read1, Read2 從第 86 bp 開始可以匹配，這代表了這一個基因序列長度是 86*2 + (150 – 86) = 236 bp，其他的 Single-Read 跟 Paired-End 差別可以參考網站。

CATCTCCCAGATTCAAGTGAGTCTCCTGCCTCAGCCTGCTGGGTAGTTCAGATTATAGGCATGTGC
GTAGAGGGTCTAAGTTCACTCAGAGGACGGAGTCGGACGACCCATCAAGTCTAATATCCGTACACG

How to do Fastq Quality Control?

其他參考文章：VCF – Variant Calling Format 基因變異儲存格式